Mejorando el diagnóstico molecular de aniridia y síndrome de WAGR

MEJORANDO EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE ANIRIDIA Y SÍNDROME DE WARG EMPLEANDO CGH-ARRAY PERSONALIZADOS DE ALTA RESOLUCIÓN


 http://www.elsevier.es/es-revista-semergen-medicina-familia-40-articulo-resumen-evolucion-las-tecnicas-citogenetica-S1138359310003199

La mayoría de los casos de aniridia y los síndromes relacionados están causados por una mutación en el gen PAX6 que está en el cromosoma 11. Todos tenemos 23 cromosomas que nos da el padre y 23 que nos da la madre. Un 30% de los pacientes con aniridia presentan reordenamientos complejos del material genético dentro del cromosoma 11, incluyendo deleciones de todo el gen (falta el gen entero), microdeleciones (falta un trozo pequeño del gen) o deleciones genéticas contiguas a PAX6, principalmente de WT1 (asociado al Síndrome de WARG).
Debido a la gran complejidad en los mecanismos involucrados en la aniridia congénita y en los síndromes asociados, la aproximación diagnóstica genética se lleva a cabo combinando diferentes aproximaciones moleculares y citogenéticas:

  1. Secuenciación Sanger para el screening intragenético de mutaciones de PAX6. Lo que se hace es leer la secuencia completa del gen para ver si hay cambios.
  2.  Hibridación Fluorescente In Situ (FISH) para el análisis de microdeleciones intersticiales. FISH es una técnica citogenética por la que se envían unas sondas que emiten fluorescencia y que se unirán al cromosoma que porta mutaciones, lo que permite visualizar y distinguir los cromosomas que presentan mutaciones
  3. Cariotipado convencional o de alta resolución para otros reordenamientos genéticos. Por medio de esta prueba se puede: contar el número de cromosomas y buscar cambios estructurales en los cromosomas. Es una prueba para ver directamente cómo son los cromosomas, lo cual puede ayudar a identificar problemas genéticos en los que falten trozos grandes del cromosoma como sucede en la aniridia. 
  4. Amplificación de Sondas Dependiente de Ligandos Múltiples (MLPA). Es un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), que permite realizar una cuantificación relativa del número de copias normales y anormales de ácido desoxirribonucleico (ADN) de hasta 40 secuencias genómicas diferentes. Permite un análisis rápido y seguro de deleciones en PAX6 y WT1, pero tiene el inconveniente de que sólo identifica ciertos tipos de reordenamientos. Además no permite la determinación de los límites de las Variaciones del Número de Copias (CNVs) y el mapeo de los puntos de ruptura. Resolver estas limitaciones es crucial para el correcto diagnóstico de deleciones en la región PAX6 en recién nacidos con aniridia esporádica, en los que el análisis de la deleción en el brazo corto del cromosoma 11 (11p13) debería ser prioritario para descartar un síndrome de WARG.
  5.  CGH Array o hibridación genómica comparativa ha demostrado ser una aproximación más sensible para el análisis de las CNVs que las técnicas de MLPA, por ello se están empleando para la detección de estas variaciones en pacientes que presentan discapacidades y/o defectos al nacimiento. El array CGH (también conocido como cariotipo molecular) es una técnica utilizada en diagnóstico genético que nos permite analizar el genoma completo de un individuo en busca de alteraciones de ganancia o pérdida de material genético. Para ello se hace uso de las últimas técnicas en biología y citogenética molecular, evitando realizar cultivos celulares, o bandeo cromosomico con tripsina/giemsa, lo que reduce considerablemente los tiempos de espera para obtener el resultado respecto al cariotipado convencional, siendo además capaz de detectar delecciones (falta de trozos de ADN) o inserciones (introducción anómala de trozos de ADN) con mucha mayor resolución. Aunque muchos autores han establecido la efectividad del análisis de microarrays para el estudio de malformaciones oculares congénitas, muy pocos estudios han llevado a cabo un análisis de las microdeleciones en  11p13 en pacientes con aniridia o síndromes relacionados mediante array-CGH de alta resolución.
  6.  CGH Array de alta resolución. Supone una mejora en la precisión de la identificación de pequeños CNVs y una mejora en el mapeo de los puntos de ruptura. En este estudio se emplea este método para cubrir la región 11p13 para estudiar los reordenamientos en la región genética donde se ubica WARG. 

Las deleciones del brazo corto del cromosoma 11 son frecuentes en los casos de aniridia congénita y en el Síndrome de WARG. El primer nivel para el diagnóstico genético en anirida para detectar reordenamientos del cromosoma 11 incluye: 

  • MLPA (Amplificación de Sondas Dependiente de Ligandos Múltiples)
  •  Cariotipo

Sin embargo ninguna de esas aproximaciones permite obtener una imagen completa de la complejidad de las deleciones y puntos de ruptura cromosómicos en aniridia
En el presente estudio se expone el desarrollo y validación de la técnica: CGH Array personalizados de alta resolución, también conocida como WARG-array, lo que permite un análisis de alta resolución de CNV en el locus de WARG. Esta técnica permitió aumentar el ratio de detecciones en una cohorte española de 38 paciente con aniridia, síndrome de WARG y otras malformaciones oculares, permitiendo caracterizar cuatro casos de aniridia no diagnósticados, y confirmar los hallazgos obtenidos con MLPA en otros cuatro pacientes. Esta herramienta representa una buena estrategia para el diagnóstico genético de aniridia y de los síndromes asociados, permitiendo una detección más precisa de micro CNVs, así como una mejor delimitación de los puntos de ruptura cromosómica. Los resultados subrayan la importancia clínica de llevar a cabo un exhaustivo y preciso análisis de los reordenamientos cromosómicos para pacientes con aniridia, especialmente recién nacidos y aquellos con defectos en PAX6 tras el diagnóstico de screening. Como conclusión los resultados muestran los beneficios del uso de WARG-array, frente a CMA y a MLPA, para mejorar el diagnóstico de aniridia y síndromes relacionados. La utilización de CGH Array personalizados de alta resolución complementa los análisis de rutina clínicos, permitiendo un diagnóstico molecular más preciso y refinado de las microdeleciones de 11p13 e incrementando la detección de reordenamientos cromosómicos en la muestra de pacientes del estudio. 
Artículo original:http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0172363

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